手性1-苄基-1,2,3,4,5,6,7,8-八氢异喹啉是合成众多天然产物和药物活性化合物的关键前体，但其高效不对称合成仍然具有挑战性。近日，中国科学院天津工业生物所朱敦明研究员、吴洽庆研究员带领的生物催化与绿色化工团队以1-(4-甲氧基苄基)-3,4,5,6,7,8-六氢异喹啉（1a）为模式底物，从上百个野生型亚胺还原酶中筛选出了(S)-选择性>99%的酶，通过酶工程改造使得酶的活力以及底物耐受能力得到显著的提升。该研究不仅拓宽了亚胺还原酶的底物适用范围，也为酶法绿色、经济、高效合成镇咳药右美沙芬关键中间体的工业化应用奠定了基础。

亚胺还原酶催化不对称合成右美沙芬关键中间体

(S)-1-(4-甲氧基苄基)-1,2,3,4,5,6,7,8-八氢异喹啉((S)-2a)是合成镇咳药右美沙芬的关键中间体，其合成方法以化学法为主，包括外消旋体的动力学拆分、铱或钌催化不对称加氢等（图1a、1b）及生物催化方法（图1c）。2019年，作者课题组首次报道了亚胺还原酶（IRED）催化不对称还原亚胺中间体1a合成(S)-2a（图1d），但是，野生型酶IR30活力低、底物耐受性较差。

图1.手性1-苄基-八氢异喹啉合成方法（来源：Org. Lett.）

作者以1-(4-甲氧基苄基)-3,4,5,6,7,8-六氢异喹啉（1a）（10 mM）为模式底物，筛选上百种野生型IRED，其中来源于Jiangella muralis的IR61表现优异的对映体选择性（>99% ee）。随后以野生型酶IR61（WT）为模板，通过建模和对接选点，在活性中心10Å范围内选取了45个氨基酸残基，建立饱和突变体库进行筛选。筛选出了五个阳性突变体P123A，P123G，W179A，W179G，F182S，与IR61相比，催化效率都有明显的提高。

为了进一步提高活性，以残基P123、W179构建了两点饱和突变体库，获得的阳性突变体中P123A/W179G（M1）催化效率最高，以M1为模板，对F182进行饱和诱变。筛选结果中发现三点突变体P123A/W179G/F182I（M2）的催化效率相比IR61提高了160倍。此时，使用M2可以在更高浓度（50 mM）下还原1a，并且ee值＞99%。底物1a空间位阻较大并且位于底物进入通道口的P123向小体积A123的突变使催化活性有显著提高。鉴于此，作者以M2为模板，选择了底物的进入通道口上的6个残基建立饱和突变体库。筛选得到的突变体 P123A/W179G/F182I/L212V（M3）的催化效率相对IR61提高了298倍。最后，作者以M3为模板，选择NADPH入口隧道的两个点构建饱和突变体库。筛选得到阳性突变体V69Y/P123A/W179G/F182I/L212V（M4），与WT相比，其催化效率提高了766倍。

为了深入了解催化活性提高的机制，作者对WT及其突变体M4与底物1a复合物的分子动力学模拟（MD）进行了研究。其中WT-1a和M4-1a的结合自由能分别为-26.03±0.05和-29.08±0.05 kcal/mol，自由能的降低反映出的底物结合亲和力的变强，这可能是催化效率提高的主要因素，这与实验测定的K_m值变化情况相一致。由于P123和L212位于通道口处，将它们突变成小体积的氨基酸A和V后，拓宽了通道入口，提高了催化效率。此外，原本位于活性口袋中的W179和F182的大侧链限制了口袋体积，影响了底物与NADPH的结合。W179G以及F182I向小体积氨基酸的突变，使原本的大体积侧链收缩，结合口袋体积也随之变大。这与WT-1a和M4-1a的活性口袋体积（分别为367.71和399.41ų，图2B）的变化相契合。这一改变使得底物在结合口袋中构象也会更加多样性，酶催化效率进一步增加。

此外，由于侧链长度增加，Y69将环V68-R75从WT的位置中推开。在WT中，D96与相邻环路中的Y71形成了氢键，但Y71的偏移破坏了这种相互作用，导致D96侧链与相邻的T97形成了新的氢键（图2C）。一系列的变化改变了局部空间结构，形成了新的通道，这可能更有利于底物的进入或产物的释放。

图2. A) IR61-NADPH-1a和M4-NADPH-1a MD轨迹最具代表性结构中活性残基的分布；B) 突变位点179和182导致的活性口袋体积变化；C) V69Y突变位点导致新通道开口的形成。（来源：Org. Lett.）

作者检测了WT以及突变体M4对不同结构类型底物的活性，测定结果如图3所示，无论是IR61或M4对于4-取代底物（1a-1d）均检测出催化活性，并且突变体M4针对底物1b-1d的酶活相对于IR61提升的也极为显著。M4针对3-取代的底物1e和1f的酶活均大于1 U/mg，其相对于IR61的提升均在60倍左右。IR61针对2-取代的底物1g、1h以及1j没有测到明显的催化活性，对于底物1i的活性也表现的极低。但突变体M4针对2-取代底物均检测出催化活性，其中对1i的催化活性提高了65倍。以上说明五点突变体M4对1a及其类似物的催化活性均有明显提升。

图3. WT和M4对1-苄基-六氢异喹啉及其衍生物的酶活（来源：Org. Lett.）

使用M4的粗酶液在2小时内可将200 mM的1a完全转化为(S)-2a，将反应规模放大到500 mL体积，M4在2小时内将1a（200 mM）转化完全，并且ee值>99%，分离收率为77%，时空产率为542 g L^-1 d^-1。

作者通过对IRED的筛选和定向进化，开发出了一种酶法高效不对称还原合成右美沙芬关键中间体(S)-2a的方法。研究发现，突变体M4的催化效率提高了766倍，可在制备规模反应中转化200 mM 1a，为获得镇咳药右美沙芬中间体(S)-2a提供了一条环境友好且经济的途径。该突变体对一系列苯基取代的1-苄基-3,4,5,6,7,8-六氢异喹啉衍生物的活性也有显著提高。

该研究工作得到国家重点研发计划、中国科学院战略性先导科技专项、国家自然科学基金、天津合成生物技术创新能力提升项目和中国博士后科学基金的支持。相关研究成果近日以封面文章发表在Organic Letters期刊上，天津科技大学与天津工业生物所联合培养的硕士生林晓枫、中国科学院大学硕士生李奕轩以及天津工业生物所博士后徐泽菲为该论文并列第一作者，朱敦明研究员、吴洽庆研究员和姚培圆研究员为该论文的通讯作者。