研究进展：单分子定位显微镜（SMLM）是一种强大的成像工具，可显著提高空间分辨率至纳米级，可视化单个分子的分子相互作用、蛋白质分布、细胞器结构和催化反应。能够在明亮（ON）和黑暗（OFF）状态之间切换荧光分子是分辨率超过衍射极限的一个关键方面，这种切换机制确保了单个分子的荧光发射在时间上被分离并且可以准确定位。研究人员已经开发了强激光照射和高浓度的外源性亲核试剂或氧化还原调节剂的组合等几种方法来微调有机荧光团的化学平衡，旨在实现高效的开/关切换，以及已经设计了各种光活化荧光团，使其能在紫外线或蓝光的辅助下从OFF状态切换到ON状态。然而，外源性添加剂和高功率或紫外激光照射可能具有细胞毒性并破坏细胞生理。虽然用于成像的纳米形貌点积累（PAINT）通过与靶点的结合和解结合事件实现ON/OFF切换，其具有良好的生物相容性，但其应用受到低通量和采集时间过长的限制，给活细胞的动态成像带来了挑战。
HMSiR（羟甲基SiR）是Urano集团首创的第一种自发闪烁染料，其可以通过可逆的PH依赖化学反应自发闪烁，无需高功率/紫外激光照射或任何添加剂，极大地扩展了SMLM在活细胞超分辨率成像中的应用。羟甲基亲核试剂可以与中位碳可逆地形成非发色螺醚，从而实现ON/OFF切换。罗丹明探针存在于非荧光螺旋环和荧光两性离子之间的平衡中以产生荧光性，其与常用的自标记标签Halo Tag具有良好的相容性，Halo Tag可促进螺环罗丹明偶联形成荧光两性离子，从而具有良好的荧光增强效果，为超分辨率成像提供了一个有力的选择。
解决方案：基于以上研究背景，作者开发了一种致闪烁探针HM-DS655-Halo，该探针前体HM-DS655是依赖于pH的自闪烁探针，其可能导致非目标相互作用产生额外的闪烁信号，但HM-DS655-Halo却表现出独特的“致闪烁”特性，仅在识别目标时产生荧光闪烁。作者对该探针进行不同pH值的荧光响应测试，结果表明HMD-S655-Halo在与Halo Tag结合前呈现自发闪烁的OFF状态，强调了HM-DS655-Halo在SMLM成像中抑制背景信号的能力。在加入Halo Tag后，HM-DS655-Halo表现出明显的荧光发射，并显著增强7.2倍，这表明Halo Tag稳定了HM-DS655-Halo的两性离子形态，促进了ON态的形成，并且显示出多个荧光ON/OFF开关周期，测试RDC值为12，其呈现出良好的致闪烁性和背景抑制（图1）。此外，增加的周期数和延长的ON-time有助于更快的成像、增强定位精度和提高分辨率。
图1：（a）HM-DS655-Halo在不同pH下的荧光光谱。（b）HM-DS655-Halo在668 nm处的荧光强度随pH值的变化。（c）HM-DS655-Halo在有无过量Halo Tag蛋白时的荧光光谱。（d-e）HM-DS655-Halo的单分子荧光时间轨迹示意图。（f）HM-DS655-Halo和HM-DS655-SNAP的RDC值比较。
HM-DS655-Halo具有特异性和低闪烁背景。作者用不同浓度的HM-DS655-Halo对活的HeLa细胞进行SMLM成像，显示了清晰的细胞核图像，证明了HM-DS655-Halo在抑制闪烁背景的情况下，适用于活细胞的SMLM成像。HM-DS655-Halo可以在100秒内以10秒的时间分辨率跟踪线粒体动力学，捕获各种裂变（ROI 1）和接触（ROI 2）事件，并且其能够跟踪微丝的纳米级运动，揭示了肌动蛋白组装形成假足的整个过程（ROI 1）和驱动细胞迁移（ROI 2），可以在纳米尺度上实时检测丝状伪足的生长速度（图2）。
图2：（a）板状足和丝状伪足的示意图。（b）HM-DS655-Halo对在活HeLa细胞中对微丝进行长期SMLM成像。（c）丝状伪足的形成过程示意图。（d）使用代表不同时间间隔的彩色线条的伪足形成过程。（e）板状伪足区域的时间依赖性。（f）驱动细胞向前迁移的板状伪足。
结论：综上所述，作者报道了一种致闪探针HM-DS655-Halo，它在与HaloTag结合之前保持闪烁关闭状态，结合以后触发其自闪烁活性，并使其能够在活细胞中无需冲洗步骤直接进行SMLM成像，采用自闪烁激活前后占空比的比值，称为参数“RDC”来表征闪烁生成性，其计算结果为12，确保了在活细胞中有效抑制背景信号的超级可闪烁性。HM-DS655-Halo成功应用于各种细胞内亚结构包括线粒体裂变和接触，细胞迁移和假足生长在内的动态SMLM成像，突出了其在SMLM成像中的潜在应用。
参考文献：Zhaochao Xuet al.Spontaneously Blinkogenic Probe for Wash-Free Single-Molecule Localization-Based Super-Resolution Imaging in Living Cells. Angew. Chem. Int. Ed. 2024, e202417469.
