研究进展：嵌合抗原受体T细胞（CAR-T细胞）疗法在治疗血液系统恶性肿瘤方面展现出显著潜力，但其在体内的动态分布和治疗效果评估仍面临挑战。传统的监测方法（如流式细胞术、免疫组化实验）依赖侵入性活检，难以实现实时、非侵入性监测。此外，现有的间接标记（如报告基因）和直接标记（如荧光染料）方法存在操作复杂、标记稀释或影响细胞功能等问题。因此，开发一种高特异性、非侵入性的CAR-T细胞追踪技术具有重要意义。

解决方案：作者选用双特异性BC19 CAR-T细胞为靶细胞，通过改良技术筛选适配体，经多轮正负筛选，从大量随机寡核苷酸库中富集与CAR-T细胞特异性结合的序列。作者首先进行适配体筛选，以双特异性BC19 CAR-T细胞为阳性筛选靶细胞，非靶向细胞（Mock-T）为阴性筛选细胞，用含36个核苷酸随机区域的单链DNA文库进行多轮筛选（图1）。每轮筛选后，经定量聚合酶链反应（qPCR）分析确定最佳PCR循环数，作者通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离单链DNA。利用qPCR扩增曲线、熔解曲线和流式细胞术监测富集程度，11轮筛选后对序列测序，作者挑选8个候选适配体。

接着，作者对候选适配体进行特性分析，合成适配体后，经流式细胞术、细胞荧光成像等实验，从结合特异性、亲和力等方面评估，确定A3为最佳适配体。通过胰蛋白酶处理CAR-T细胞、SDS-PAGE和表面等离子共振等实验，作者确定A3的靶蛋白为BCMA-CD19-His蛋白。随后研究A3对CAR-T细胞功能的影响（图2），作者检测了CAR表达率、T细胞激活标志物表达和体外杀伤功能，结果显示A3不影响其功能。评估A3血清稳定性，作者发现其在血清中稳定性良好。然后，作者构建了Nalm6荷瘤小鼠模型，用Cy5标记A3进行体内荧光成像，验证其跟踪CAR-T细胞的能力。最后，作者利用A3微珠和互补逆转剂实现CAR-T细胞体外无痕富集，提高其阳性率。

图1：（A）流式细胞术检测不同文库与CAR-T细胞和Mock-T细胞的结合性能示意图。

图2：（A）DAPI染色并与适体A3共培养的CAR-T细胞和Mock-T细胞的共聚焦图像示意图。

结论：本研究成功筛选出高亲和力、高特异性的DNA适配体Aptamer A3，能够非侵入性、动态监测CAR-T细胞在体内的分布和增殖，并实现高效无痕富集。该技术避免了基因修饰的复杂性，为CAR-T疗法的疗效评估和临床优化提供了新工具。未来可通过放射性核素标记进一步拓展其在PET成像中的应用潜力。

参考文献：Zheng J N et al. Development of a DNA Aptamer-Based Approach to Noninvasively Image CAR-T Cells In Vivo and Traceless Enrichment In Vitro. Adv Sci. 2025, DOI:10.1002/advs.202506746.