一、需建立细菌内毒素检查项目的品种

　　1、用于注射给药（静脉滴注、静脉注射、鞘内注射、腹腔注射及较大的肌内注射等）但未采用细菌内毒素检查法或家兔热原检查法其一控制质量的的注射用药品、生物制品以及未上市需要建立质量标准的注射用新药；

　　2、用于静脉给药的原辅料，包括易污染内毒素的原料（如抗生素）、无菌分装原料、制剂工艺中无除内毒素和无灭菌过程产品的原料药（如生化药品、生物制品）及在制备分装过程无法控制内毒素的原辅料，应设置细菌内毒素检查项。

　　3、质量标准中有家兔热原检查法需转换为细菌内毒素检查方法的品种。

　　4、注射用药品、生物制品建立细菌内毒素检查方法时，为验证不同样品和不同鲎试剂反应的一致性，要求同时使用两个鲎试剂厂家的鲎试剂对每个品种至少三批样品（如为上市品种应检测两个以上生产厂家的样品）进行干扰试验，以确定该品种是否对内毒素和鲎试剂的反应存在干扰作用，能否使用内毒素检查法进行检验。

　　如同一样品对两种鲎试剂结果差异较大，应使用第三厂家的鲎试剂以探讨采用内毒素检查法的可能性。

　　5、若经过方法学验证证实样品对内毒素存在不能排除的干扰作用，不能建立细菌内毒素检查项时，应采用热原检查控制注射剂的质量。

　　二、建立细菌内毒素检查试验方法

　　1。 确定内毒素限值

　　1。1  限值的计算

　　具体可参考细菌内毒素检查相关计算小结。

　　1。2  限值确定建议

　　？  通过公式得到限值后，还需查阅国外药典是否已收载该品种，参考已有的限值，选择其中最严格的作为该品种的限值。如特殊用药、联合用药时，可对限值进行调整，如抗感染、抗肿瘤、治疗心血管疾病等重症用的药品、需联合用药的药品，可严格至计算限值的1/2或1/3。

　　？  在注射剂一致性评价前提下，建议选择光度法进行定量测试。

　　2。 实验准备

　　2。1  实验所用材料、器具

　　使用器具耗材要做到无热原及不吸附细菌内毒素，细节不扩展。

　　2。2  实验用试剂

　　试剂本身要无热原且不影响内毒素检出，有两个建议：1。选择同一厂家的鲎试剂、细菌内毒素检查用水、工作标准品；2。非必要减少自制试剂，厂家成品试剂相对更实用。

　　2。3  实验用样品

　　2。3。1 样品本身需要溶解在溶剂中，除另有规定，使用细菌内毒素检查用水溶解、稀释，如不溶解（且无其他有效溶剂）时需要在制备过程加入内毒素溶液来证明取上清液是可行的；

　　2。3。2 样品本身内毒素含量应较低，如含量过高将无法判断样品是否存在增强干扰作用。

　　2。3。3 对于不溶于水的供试品，可以格局供试品的特性选择相应的溶剂，如乙醇等。为确认溶剂不影响内毒素的检出，需要对溶剂进行不干扰稀释倍数的验证以及内毒素含量的检验。

　　2。4  鲎试剂

　　需要两个厂家的鲎试剂，如果第一次使用需要注意凝胶法鲎试剂进行灵敏度实验，光度法鲎试剂进行标准曲线的可靠性试验。

　　2。5  干扰预实验

　　预实验的目的是初步确认供试品的最大不干扰浓度或最小不干扰稀释倍数。为了减少试验的摸索过程和节约成本，可在正式试验前开展干扰试验预实验。

　　首先需要说明此处的预实验不同于数据完整性要求的不准预实验的预实验，不是为了投机取巧；其次本试验并不是必须要进行的，在要参考资料或充分研究或者进行分析方法转移时可以不进行干扰试验预实验。

　　2。5。1 具体方法

　　将未检测到内毒素的供试品进行一系列倍数的稀释，但最大稀释倍数不得超过MVD（0。03EU/ml对应的）。

　　使用鲎试剂对每一稀释倍数进行检验。每一稀释倍数下做2支供试品管和2支供试品阳性对照。同时做阳性对照级阴性对照。保温60±2min后，观察并记录结果。

　　2。5。2 结果判断

　　当阴性对照为阴性，阳性对照为阳性时，实验有效。当系列浓度出现供试品溶液2管为阴性，供试品阳性2管为阳性时，认为供试品溶液哎该浓度下不干扰实验，此稀释倍数即为最小不干扰倍数。

　　2。5。3 个人思考

　　？  对于是否采用2个厂家鲎试剂进行干扰实验预实验，个人认为如选择一个厂家的鲎试剂进行试验，选择得到的最小不干扰倍数的2倍稀释级进行干扰试验，这样同样可以起到预实验目的；使用2个厂家的鲎试剂有助于提前发现，两个厂家鲎试剂对照品的反应结果差异大的问题（不干扰倍数超过3个稀释梯度等情况），所以未做任何研究无参考的样品建议选择2个厂家鲎试剂进行预实验。

　　？  对于供试品不为阴性可能增强作用或供试品阳性不为阳性可能存在抑制作用，为避免此类情况，首先测试前可以确认pH，pH不适宜不进行干扰预实验；也可查阅资料确认其理化性质及生物学特性确认是否存在干扰因子，（可参考细菌内毒素检查（凝胶法）的干扰因素有哪些？）。

　　？  存在干扰作用时，为确保所选用的处理方法能有效地排除干扰且不会使内毒素失去活性，要使用预先添加了标准内毒素再经过处理的供试品溶液作为供试品阳性对照进行干扰试验。

　　？  不建议选择原液进行预实验，不便于供阳制备；

　　？  不建议直接根据鲎试剂对应的灵敏度选择MVD进行试验，检验结果报告小于L值，容易被挑战。

　　？  不建议选择供试品组为阴性但是明显浑浊或凝胶脱落的稀释级作为不干扰稀释级。

　　？  对于产品不稳定导致批次间差异大这种情况，个人的建议还是选择一批进行预实验时，选择下一个稀释级进行正式干扰试验。

　　3。 正式干扰试验

　　正式干扰试验的实验的实质，通过比较鲎试剂与再水溶液中的内毒素和再供试品溶液中的内毒素反应结果的差异程度，来确定供试品在该浓度下是否对内毒素检查有干扰。因此，用水稀释的标准系列与供试品稀释的标准系列必须同时制备，同时与鲎试剂进行反应。

　　此处不对干扰试验步骤进行赘述，具体细节参考中国药典规定即可。

　　干扰试验的主要注意事项与细菌内毒素检查不同的地方就在于干扰预实验的设计。故不再赘述细菌内毒素检查的注意事项。

　　干扰试验关于干扰因素的论述细菌内毒素检查（凝胶法）的干扰因素有哪些？中已做详细描述，此处不再重复。

　　最后提醒：B组仅有2λ凝固且与C组相差较大时（C组的0。25λ浑浊）或B组0。25λ浑浊或凝胶变形而C组λ部分为阴性时，此时的干扰试验虽然合格，但是未边缘情况建议选择更适宜的稀释级或方法进行干扰试验。

　　写在文末：凝胶法内毒素总结已完成，光度法自学中，后续大家期望看到那些微生物检验相关的总结，欢迎评论区留言。

　　本文作者：博普智库作者-杋稞

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