1. 第一篇例文题目为“CircECE1 activates energy metabolism in osteosarcoma by stabilizing c-Myc”，于2020年10月发表在《Molecular Cancer》杂志。

   作者研究发现CircECE1在骨肉瘤组织和细胞中高表达，在体外和体内CircECE能够抑制肿瘤的增殖和转移。机制上，CircECE1与c-Myc相互作用，防止c-Myc泛素化和降解。由于c-Myc能够促进糖酵解，因此作者通过Seahorse实验探究骨肉瘤中CircECE对糖酵解和能量代谢的影响。如图1所示，CircECE促进骨肉瘤细胞氧化磷酸化并抑制糖酵解。

图1 Seahorse实验证明CircECE促进骨肉瘤细胞氧化磷酸化抑制糖酵解

    为了证明CircECE是通过与c-Myc相互作用进而影响细胞能量代谢，作者构建CircECE MUT（该位点突变会影响CircECE与c-Myc的结合）过表达材料，使用Seahorse实验进一步检测CircECE MUT对细胞能量代谢的影响。如图2所示，CircECE MUT能够回复CircECE WT对糖酵解的增强和对氧化磷酸化的抑制。

图2 Seahorse实验证明CircECE MUT回复CircECE过表达对细胞能量代谢的影响

    作者研究发现，ZEB1作为转录因子，能结合在磷酸果糖激酶1 (PFKM)的启动子上并激活其mRNA表达。已知PFKM是糖酵解过程中的限速酶，作者发现在肝癌中沉默ZEB1可以导致PFKM表达下调，细胞增殖和侵袭能力变弱。为了证明肝癌中ZEB1对糖酵解的调控作用，作者进行了Seahorse实验。如图3D所示，在肝癌中ZEB1能够促进胞外酸化，表现在促进糖酵解通量和糖酵解能力；同时又能够促进线粒体氧化磷酸化，表现在增强基础呼吸和产生ATP。

图3 Seahorse实验证明肝癌细胞中ZEB1敲低能够抑制糖酵解和氧化磷酸化

为了证明ZEB1是通过转录水平激活PFKM进而影响细胞能量代谢，作者在ZEB1稳定敲低的基础上过表达PFKM，使用Seahorse实验进一步检测ZEB1敲低以及PFKM过表达对细胞能量代谢的影响。如图4所示，PFKM过表达能够回复ZEB1敲低对糖酵解和氧化磷酸化的抑制。

图4 Seahorse实验证明肝癌细胞中ZEB1敲低能够抑制糖酵解和氧化磷酸化

可见Seahorse XF可发表于顶级期刊，下面我们就简单介绍下Seahorse XF吧

一、 细胞能量代谢简述

哺乳动物正常细胞有两条关键的能量代谢通路，即有氧呼吸和糖酵解。有氧呼吸主要在线粒体中进行，该过程消耗氧气驱动细胞将营养底物（糖、脂、蛋白质）氧化分解并释放出能量合成大量ATP，因此线粒体又被称为细胞的“能量工厂”。糖酵解发生在细胞胞浆中，是一种无氧分解过程，主要将葡萄糖分解成乳酸并产生少量ATP。糖酵解和氧化磷酸化是细胞中两条关键的能量产生途径。大多数细胞具有在这两条途径之间切换的能力，从而适应环境的变化。而肿瘤细胞更偏向使用糖酵解作用取代一般正常细胞的有氧循环，所以癌细胞使用线粒体的方式与正常细胞就会有所不同，这种现象被称为瓦氏效应（图5）

图5 哺乳动物细胞的能量代谢途径

“人是铁，饭是钢，细胞活动需能量”，能量代谢驱动细胞功能。随着医学科学、基因组学及蛋白组学的发展，我们逐渐认识到生物能量与许多疾病因果有着十分密切的关系。癌症、心血管疾病、糖尿病、肥胖、神经退行性疾病、衰老以及各类药物毒理机制等都与能量的供需息息相关。Seahorse代谢分析仪通过同时对细胞产生ATP的两条代谢通路—线粒体氧化磷酸化和糖酵解进行实时动态检测，从而直接表征细胞代谢的动态变化。

1. 线粒体压力测试

线粒体压力测试实验通过依次加入线粒体电子传递链（ETC）的靶向药物测量细胞的氧气消耗速率（OCR）而得到反映线粒体功能的关键参数，包括basal respiration、ATP-linked respiration、proton leak、maximal respiration、spare respiratory capacity和nonmitochondrial oxygen consumption。

图6 线粒体压力测试实验药物作用模式图

    该实验使用的药物为oligomycin、FCCP、rotenone/antimycin A，加入顺序及 ETC 靶点（图6），以下为药物的原理解释：

Oligomycin：该药物抑制ATP合酶，在测量细胞基础呼吸后第一个加入，该药可以引起线粒体呼吸或OCR减少。

FCCP：该药在oligomycin后加入，是一种解偶联剂，加入该药会引起电子在ETC不受限制地传递，同时复合物Ⅳ的耗氧达到最大。FCCP刺激的OCR可被用来计算细胞备用呼吸能力。

Rotenone/antimycin A：第三次加入的药物，是rotenone和antimycin A的混合物。Rotenone是复合物Ⅰ的抑制剂，antimycin A是复合物Ⅲ的抑制剂。这两种药物可关闭线粒体呼吸，从而计算由线粒体之外活动所驱动的非线粒体呼吸耗氧。

图7 线粒体压力测试检测结果

Basal respiration：用于满足细胞的 ATP 需求和质子漏的耗氧。代表细胞在基础状态下的能量需求。

ATP-linked respiration：加入oligomycin后产生的耗氧下降部分，用于驱动ATP合成。代表线粒体满足细胞能量需求的ATP合成能力。

Proton leak：基础呼吸减去ATP相关呼吸的剩余耗氧。质子漏可作为线粒体损伤的标志，也可被认为是调节线粒体ATP合成的一种机制。

Maximal respiration：加入FCCP后获得的细胞最大耗氧。代表了细胞能够实现的最大呼吸速率。

Spare respiratory capacity：最大呼吸减去基础呼吸的耗氧。细胞响应需求的能力可作为细胞适应性或灵活性的指标。

2. 糖酵解压力测试

葡萄糖在胞浆中转化为丙酮酸，进一步转化为乳酸，并向细胞外环境中释放质子，引起胞外环境的酸化，本实验即测量细胞的胞外酸化率（ECAR）。需要注意，糖酵解压力测试实验的检测液中没有glucose和pyruvate，因此配制检测液时勿加入这两种底物。本实验通过依次加入glucose、oligomycin和2-DG来得到反映细胞糖酵解功能的参数，包括Glycolysis、Glycolytic capacity、Glycolytic reserve和Non-glycolytic acidification。 

图8 糖酵解压力测试实验药物作用模式图

Glucose：实验第一次加入的药物是饱和浓度的葡萄糖，细胞通过糖酵解途径利用该葡萄糖并将其分解为pyruvate，产生ATP、NADH、水和质子。质子释放入胞外环境引起ECAR的迅速升高，被称为细胞在基础条件下的糖酵解能力。

Oligomycin：实验第二次加入的药物为oligomycin，ATP合酶的抑制剂，可抑制线粒体ATP产生，从而将能量产生转移至糖酵解通路，引起 ECAR 进一步升高，反映了细胞最大的糖酵解能力。

2-DG（2-deoxy-glucose）：2-DG是最后加入的药物，该药通过竞争性结合糖酵解途径的己糖激酶而抑制糖酵解，引起ECAR降低从而证实实验中ECAR的产生来源于糖酵解途径。

图9 糖酵解压力测试检测结果

Glycolysis：葡萄糖转化为丙酮酸的过程，本实验中加入饱和浓度葡萄糖后细胞达到的ECAR值，反映细胞在基础条件下的糖酵解能力。

Glycolytic capacity：加入oligomycin后，细胞达到的最大ECAR 值，指oligomycin 有效关闭了氧化磷酸化功能后，迫使细胞利用糖酵解达到的最大产生能量的能力。

Glycolytic reserve：Glycolytic capacity与Glycolysis的差值，反映了细胞满足能量需求的能力，以及糖酵解功能与细胞理论最大值之间的接近程度。

Non-glycolytic acidification：细胞外酸化的其他来源，非来自糖酵解途径。

图10 线粒体压力测试实验流程

讲到这里，大家对Seahorse XF的原理及使用流程是不是已经熟悉了？不知道您发现没有，这个技术其实并不难，唯独安捷伦推出的Seahorse XF仪器确实难寻。如果您的课题需要研究能量代谢，又没有相应的仪器，不用考虑了，直接来找我们吧---厦门安提海拉生物等你来！！！即日起30日内订单有优惠，双十一特惠8折起~

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