2012年，研究人员在香荚兰和部分仙人掌种皮中发现了一种新颖的儿茶酚木质素类型，称为“C-木质素”。该木质素是由单一的咖啡醇结构单元通过苯并二恶烷连接形成的生物大分子，主要存在于香荚兰、仙人掌、石栗等植物种皮中。与常规木质素对比，C-木质素具有线性、均一性、耐酸性等优点，通过催化降解或化学处理可以用于制备高附加值邻苯二酚类产品和高性能材料，被认为是一种“理想型”的木质素高值化原料。自C-木质素被报道以来，该研究领域得到了快速的发展。然而，目前缺少相关综述对该领域进行系统梳理与总结分析。基于此，该综述首次系统概述了C-木质素在生物合成、分离与表征及高值利用等方面的研究进展。

G/S-木质素VS C-木质素

为了避免气候变化给人类生存带来的严重影响，利用生物质资源逐步代替或补充化石资源是一种可行的方法。木质素作为生物质原料（纤维素、半纤维素和木质素）的重要组成之一，是自然界唯一可再生的芳香类碳氢资源。目前，在大多数生物精炼模式中纤维素和半纤维素的高值利用取得了重大进展，但是木质素仍未得到充分利用。因此，解决木质素高附加值利用问题不仅可以极大地改善生物精炼过程的经济性，而且能够最大限度地提高生物质原料的综合利用价值。

木质素是一类复杂的有机聚合物，在植物细胞壁中扮演者重要的角色，如：提供机械强度、利于水分运输、防御和抵抗外界病原体和害虫的侵袭等。木质素主要是由3种基本结构单元，即芥子醇（S）、松柏醇（G）和对香豆醇（H），通过碳氧键和碳碳键连接形成的生物大分子，其中β-O-4，β-β及β-5为主要的连接键。目前，大多数植物组织中的天然木质素主要包含紫丁香基（S）和愈创木基结构单元，通常被称为G/S-木质素。该类木质素结构中包含多种基本结构单元和连接键，具有不均一性，导致其应用变得较为复杂。为了改善G/S-木质素的不均一性，科研工作者将生物工程技术用于木质素结构修饰的研究。比如：在杨木中过表达一种有利于合成芥子醇的酶，即阿魏酸-5-羟化酶（F5H），可以生成富含紫丁香基结构单元的木质素，并且β-O-4连接键占88%以上。然而，值得注意的是，在酸性条件下，天然木质素和生物工程木质素中普遍存在的β-O-4连接键容易被破坏形成更加顽固的C-C键，从而阻碍了木质素催化降解的效率和制备材料的性能。

2012年，研究人员在香荚兰和部分仙人掌种皮中发现了一种新颖的儿茶酚木质素类型，称为“C-木质素”。随后，在大戟科（麻风树、石栗、油桐及蓖麻等）和醉蝶花科（醉蝶花）植物种皮中也发现了C-木质素。与常规木质素相比，C-木质素主要是由单一的咖啡醇结构单元通过苯并二恶烷连接形成的生物大分子，具有线性和均一性（图1）。C-木质素的均一性使其可以被解聚为单一的邻苯二酚产品，理论最大单体收率可接近100%；C-木质素的线性特性使其内部几乎不存在交联，是制备碳纤维的优选原料。此外，C-木质素还具有较强的耐酸性，这一特性为从生物质基质中分离出结构完整的C-木质素提供了先决条件。因此，C-木质素被认为是一种“理想型”的木质素高值化原料。

Figure 1. Representative Chemical Structural Models of Lignin. (A) G/S- or G-lignins derived from hardwood and softwood, respectively. (B) C-lignin derived from special seed coats. (C) 5H-lignin derived from special seed coats.

C-木质素生物合成研究进展

追溯苯并二恶烷木质素的发展史

多年来，科研人员普遍认可木质素是由三种基本结构单元组成的观点，但是随着转基因植物中木质素组分的变化，这一观点逐渐开始转变。自1981年以来，研究人员在天然或者转基因植物中检测到苯并二恶烷二聚体化合物，推测该化合物可能是由5-羟基松柏醇单体组成的。直到2001年，美国威斯康辛大学Ralph团队以转基因杨木为原料，利用核磁技术首次确定了5-羟基松柏醇作为单体参与合成苯并二恶烷木质素。即使如此，研究人员认为天然植物中几乎不存在以咖啡醇或5-羟基松柏醇为基本结构单元的苯并二恶烷木质素。

2012年，美国威斯康辛大学Dixon和Ralph教授在香荚兰和部分仙人掌种皮中发现了一种新颖的儿茶酚木质素（称为C-木质素），没有检测到常见的G/S-木质素。该木质素主要由单一的咖啡醇结构单元通过苯并二恶烷连接形成的生物大分子。随后，科研工作者在部分大戟科和醉蝶花科植物种皮中也发现了C-木质素，同时也检测到了G/S-木质素。值得一提的是，在部分仙人掌植物种皮中也发现了5H-木质素，该是由5-羟基松柏醇结构单元通过苯并二恶烷连接形成的大分子。在天然植物中发现C-木质素，为其进一步研究与应用提供了原料支撑。

咖啡醇单体的生物合成

木质素生物合成路径的研究已经持续近一个世纪了，但是由于木质素结构的复杂性和多样性，在过去的几十年里，科研人员对先前报道的路径进行了不断的修订。一般来说，木质素大分子的形成过程分为三个阶段：单体的生物合成、运输和聚合。单体的合成通常发生在细胞质内，以L-苯丙氨酸和/或L-酪氨酸为原料，经过脱氨、芳香羟基化、甲基化和还原等一系列步骤生成不同类型的单体；随后，合成的木质素单体被转运到质外体，经过氧化聚合形成木质素大分子。由木质素生物合成路径可知，在木质素合成过程中若缺乏咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶（CCoAOMT）和咖啡酸-O-甲基转移酶（COMT）可能会阻碍木质素单体发生甲基化，但在转基因拟南芥和苜蓿植物中直接下调CCoAOMT和COMT的表达并没有产生C-木质素，该结果表明咖啡醇单体的生物合成可能受到多种酶调控。

2013年，Dixon和Ralph发现在醉蝶花植物种皮成熟过程中C-木质素和G-木质素的形成在空间和/或时间上是相对分离的，即植物授粉12天左右（记为12 DAP）G-木质素停止沉积，同时C-木质素开始生成并积累。基于RNA测序和生物信息学分析手段，Chen和Dixon团队报道了一整套关于醉蝶花植物种皮木质素生物合成的基因。根据大肠杆菌中重组酶转录与动力学分析结果可知，醉蝶花植物种皮中由G-木质素沉积向C-木质素积累的转变过程与下调CCoAOMT、COMT和肉桂醇脱氢酶（ChCAD4）表达和上调ChCAD5表达密切相关。进一步的研究表明，醉蝶花植物种皮中OMTs和甲硫氨酸合成酶的下调可能是形成C-木质素的主要因素，并且ChCAD5的表达可能有助于咖啡醛向咖啡醇的转化。

咖啡醇单体的聚合

植物细胞壁中木质化通常是指酶催化单木质醇（芥子醇、松柏醇及对香豆醇）氧化聚合的过程，C-木质素的形成也是如此。2012年，Dixon和Ralph团队以辣根过氧化物酶和过氧化氢为催化剂，开展了体外氧化聚合咖啡醇制备C-木质素多聚体模型化合物的研究。核磁结果显示C-木质素模型化合物中苯并二恶烷结构单元具有反式和顺式构象，说明该结构单元是通过β-O-4型末端自由基耦合反应形成的。与G/S-木质素合成相比，咖啡醇单体苯环上3位的酚羟基可以使分子内闭合具有动力学优势，从而能够选择性地形成苯并二恶烷结构单元。

2020年，Dixon教授课题组从醉蝶花植物中发现了一种种皮特异性漆酶（ChLAC8），该酶表达与C-木质素积累具有较强的相关性。在大肠杆菌中进行的重组研究表明，ChLAC8可以选择性地催化聚合咖啡醇单体，而对松柏醇聚合没有催化作用。在转基因醉蝶花植物中抑制ChLAC8表达会导致C-木质素含量明显降低，而G-木质素含量没有变化。进而，分子模型和对接研究表明ChLAC8能够与咖啡醇3位上的酚羟基形成较强的氢键，从而使咖啡醇稳定地存在具有催化活性的位置。以上结果表明，足够的咖啡醇单体和过表达ChLAC8是C-木质素的形成必要条件。

2022年，Dixon教授团队提出一个模型可以描述醉蝶花植物种皮木质素合成过程中的相关变化（图2）。在12 DAP以前，在细胞质中合成的松柏醇单体通过细胞膜被输送到外质体，然后在细胞外层木质化的亚层形成G-木质素。在13 DAP左右，木质素单体合成途径由松柏醇转向咖啡醇，这一变化与下调COMT、CCoAOMT表达和上调CAD5表达是密切相关的；然后咖啡醇单体被运输到外质体，开始形成C-木质素大分子。与此同时，在整个C-木质素生物合成过程中，松柏醇单体仍然存在，但并未参与合成木质素，这可能是由于ChLAC8可以优先氧化咖啡醇单体，导致松柏醇单体在细胞质和外质体之间的浓度梯度被打破，从而阻碍了松柏醇单体的运输。以上研究结果解释了当松柏醇单体仍在形成时，C-木质素生物合成是如何进行的，同时也说明了单木质醇的类型不足以决定木质素的组成。

总的来讲，当前的研究结果表明下调CCoAOMT和COMT表达以及上调ChCAD5和漆酶基因ChLAC8表达是导致醉蝶花植物种皮中C-木质素形成的主要因素。与此同时，这些结果为在木质纤维素体内改变木质素成分奠定了重要的基础。

Figure 2. A model for description of developmental changes in lignin composition during Cleome seed coat maturation based on the monolignol biosynthesis, transport, and polymerization.

C-木质素分离与表征

C-木质素表征

根据文献可知，C-木质素并不是植物种皮自古以来固有的特征，可能是近期在不同植物谱系中进化而来的。最近的研究结果表明仙人掌种皮中C-木质素的分布情况可能与其家族进化有关，但关于C-木质素是否在自然界中广泛存在还有待确定。因此，近十年来，许多分析方法被用于寻找和鉴定天然C-木质素。到目前为止，研究人员主要在兰科、仙人掌科、大戟科及醉蝶花科等部分植物种皮中发现了C-木质素。

Klason分析是一种测定木质纤维素生物质中G/S-木质素含量的通用方法。在前期的研究中，利用Klason分析法测定香荚兰种皮中“酸不溶性木质素”的含量约为80%。当时，得到的酸不溶木质素被认为是C-木质素。最近，采用核磁共振技术测定的香荚兰种皮中C-木质素含量约为13 wt%，这表明利用Klason分析法测定的C-木质素含量偏高。这可能是因为种皮中存在大量脂肪酸和蛋白质，导致酸水解不彻底。

硫代酸解法是目前鉴定木质素基本结构最常用的方法之一，科研工作者利用该方法发现在香荚兰种皮和130种不同仙人掌科植物种皮中均存在C-木质素。在随后的研究中，又进一步揭示了C-木质素和G/S-木质素以“共存非弓生”的形式存在于大戟科和醉蝶花科植物种皮中。需要指出的是，在硫代酸解条件下苯并二恶烷结构具有稳定性，因此该方法计算出的C-木质素含量会偏低。即使如此，硫代酸解法仍是一种快速鉴定C-木质素存在与否的有效方法，而且也可以作为一种粗略评估生物质原料中C-木质素含量的方法。

在鉴定分离木质素和整个植物细胞壁结构方面，二维核磁共振波谱是一个强有力的工具（图3）。在香荚兰种皮的异核单量子相干（HSQC）核磁共振谱中，仅可以检测到C-木质素的特征信号峰，并且能够清晰地观测到C-木质素中反式、顺式苯并二恶烷结构单元上C_α-H_α、C_β-H_β和C_γ-H_γ的相关信号峰。在大戟科和醉蝶花科植物种皮的HSQC谱图中，可以清晰地观测到来自于C-木质素的苯并二恶烷连接键和G/S-木质素的β-O-4连接键的相关特征信号峰，说明这两种木质素共存于当前植物种皮中。由异核多键相关（HMBC）核磁共振波谱分析结果可知，苯并二恶烷连接键和β-O-4连接键之间不存在直接关联的关系；以上结果可以说明在植物生长过程中C-木质素与G/S-木质素是独立合成的。此外，通过二维核磁共振波谱分析，在Escobaria dasyacantha种皮中也发现了一种特殊的线性苯并二恶烷木质素，即5H-木质素。

目前，定量¹³C核磁共振波谱是一种准确测定C-木质素真实含量的方法，因为C-木质素的特征信号峰之间基本不存在重叠峰。2018年，Ralph团队利用定量¹³C核磁共振对香荚兰种皮溴化锂C-木质素（C-LBL）进行定量分析，计算得到每克C-LBL中含有1.09毫摩尔的咖啡醇单体。按比例折算为香荚兰种皮中C-木质素的含量约为13.1 wt%；该结果远低于Klason分析（~80 wt%），而高于硫代酸解分析（70 μmol/g, 1.2 wt%）。

丹麦哥本哈根大学Barsberg团队利用衰减全反射-傅立叶变换红外光谱（ATR-FTIR）技术对三种兰科植物种皮化学成分进行了分析，在Neuwiedia和Cypripedium中发现了C-木质素，而在Phalaenopsis中没有检测到C-木质素。根据不同发育阶段植物种皮的FT-IR光谱结果，作者发现C-木质素是在G/S-木质素之后出现的。

自荧光和组织化学染色是木质素在细胞壁定位的经典成像技术之一。利用甲苯胺蓝、间苯三酚-盐酸和酸性亚硝酸盐分别处理醉蝶花科植物种皮，在显微镜下可以观测到两个不同的木质化细胞亚层，其中C-木质素主要沉积在内层。

Figure 3. 2D HSQC spectra of acetylated lignin samples from plant seed coats.

C-木质素分离

从植物种皮中将C-木质素进行分离与纯化，特别是同时含有C-木质素和G/S-木质素的原料，是实现C-木质素高值化利用的重要前提。由于香荚兰种皮中只含有C-木质素，在早期的研究中通常将其作为获取C-木质素的原料（图4）。研究人员利用Klason (KL)、酸性溴化锂（LBL）、碱性（AL）和纤维素酶（EL）等预处理方法从香荚兰种皮中分离出C-木质素，并利用核磁对其结构进行分析与表征。进一步利用二氧环/水、DMSO等溶剂处理酶解木质素，可以得到溶解性较好的木质素样品，同时也显著提高了C-木质素的比例。

虽然大戟科植物种皮中包含C-木质素与G/S-木质素，但由于其在自然界中分布广泛、来源丰富，可以作为一种获取C-木质素的理想原料。基于C-木质素和G/S-木质素“共存非共生”的特点，且分子量低于G/S-木质素，因此可以采用溶液提取方法对C-木质素进行分离纯化（图4）。2013年，Dixon和Ralph团队利用酶水解和二氧六环/水抽提法处理大戟科植物种皮，包括：麻风树、油桐和石栗等，得到的木质素样品仍然包含C-木质素和G/S-木质素，并没有有效实现两种木质素的拆分。2014年，Anastas课题组采用甲醇、二氯甲烷、乙酸乙酯溶剂连续抽提法从石栗种皮中分离有机溶剂木质素，但作者没有给出木质素表征结果；不过由催化降解结果可知，该有机溶剂木质素仅包含C-木质素。2020年，北京林业大学宋国勇教授团队报道了一种绿色、可回收的低共熔溶剂（DES）可以有效地分离蓖麻种皮C-木质素；根据HSQC分析可知，DES提取的木质素样品中含有丰富的苯并二恶烷结构。2021年，该团队利用不同的预处理方法开展了从麻风树、石栗、油桐和蓖麻种皮中拆分C-木质素和G/S-木质素的研究。通过对比各个方法的分离效率、操作步骤和能耗情况，作者认为二氧六环和稀盐酸抽提法是拆分C-木质素和G/S-木质素的最优方案。分离得到的C-木质素通过催化降解反应可以得到单一的邻苯二酚单体，无论在反应活性和单体选择性上均优于含C-木质素和G/S-木质素的原料。

Figure 4. A comprehensive representation of C-lignin isolation protocols from different plant seed coats. (A) Vanilla seed coats. (B) Euphorbiaceae plants seed coats (Jatropha, Candlenut, Tung, and Castor).

C-木质素高值化利用

C-木质素催化氢解制备儿茶酚单体

天然的G/S-木质素结构中通常包含多种结构单元和连接键，具有不均一性；通过催化降解可以得到不同类型的木质素单体化合物，不利于后续高质利用。相比于G/S-木质素，C-木质素结构单一、连接键简单，具有均一性。可以被完全转化为单一的儿茶酚单体；这些单体可以用于制备生物活性分子、药物和仿生功能材料等。2016年，美国国家可再生能源实验室Crowley和Beckham教授计算了苯并二恶烷连接键中C_α-O键和C_β-O键的平均解离焓分别为56.5和63.4 kcal/mol，接近于G/S-木质素中β-O-4连接键的解离焓，从而认为C-木质素有潜力成为下一代生物能源解决方案的关键竞争者。

早在2014年，Anastas和同事们报道了铜基催化剂氢解石栗有机溶剂木质素的研究，该催化体系主要得到具有四种不同侧链的儿茶酚单体。这可能是第一篇关于C-木质素解聚的报道，但是作者当时并没有意识到原料是C-木质素（图5）。2018年，Ralph团队以Ru/C，Pd/C和Pt/C为催化剂开展了香荚兰木质素还原催化降解研究，得到了具有不同取代基的儿茶酚单体，最高产率为89 mol%（基于香荚兰木质素中咖啡醇单体摩尔数）。其中，儿茶酚单体侧链的类型取决于催化剂金属活性中心，比如：Pd/C催化剂主要得到丙醇基儿茶酚单体M1，选择性为71%；而Ru/C催化剂主要得到丙基儿茶酚单体M2，选择性为73%。类似地，Pd/C催化氢解麻风树种皮DL得到71 mol%的儿茶酚单体，其中M1的选择性为97%。2021年，北京林业大学宋国勇教授团队率先将原子级分散的金属钌催化剂（Ru/ZnO/C）用于蓖麻种皮EMAL解聚的研究。该催化剂可以有效地切断C-木质素中所有的碳氧键，并且能够选择性地规避C=C双键加氢，从而得到以丙烯基儿茶酚单体M5为主的酚类化合物，其选择性为77%，总单体得率为66 mol%。基于Ru/ZnO/C催化剂中金属Ru的低负载量（约为0.2 wt%），C-木质素催化降解的摩尔转化数最高可达345，比商品化Ru/C催化剂高30倍。基于模型化合物研究可知，在当前催化体系下脱氢或脱水路径不适用于C-木质素氢解路径；其反应路径可能是苯并二恶烷连接键中C_α-O和C_β-O同时断裂，生成咖啡醇单体可能充当反应中间体，再通过氢解作用生成目标单体产物。该案例的成功应用将有助于开发高效的木质素催化转化体系。

还原催化分馏（RCF）是直接处理生物质原料最常用的方法之一，能够有效地实现生物质原料中纤维素、半纤维素和木质素的分级转化利用。该策略也同样适用于C-木质素的催化降解研究。2018年，Beckham和Román-Leshkov教授报道了Ni/C还原催化分馏香荚兰种皮的研究，得到约7.9 wt%的M2和M5产物（基于香荚兰种皮质量）。2021年，北京林业大学宋国勇教授课题组以Ru/C，Pd/C和Ni/C为催化剂，在DES溶剂中开展蓖麻种皮还原催化分馏的研究。在最优条件下，即Pd/C和ChCl/EG（氯化胆碱和乙二醇）体系下可以得到5.6 wt%的儿茶酚单体，主要产物为丙基儿茶酚M2，选择性为89%；该产物的选择性不同于Pd/C和甲醇体系；可能是因为DESs的酸性有助于促进C_γ-OH断裂，从而调控产物的选择性。

儿茶酚单体升级转化

为了最大化利用C-木质素创造的经济价值，Escande和Darcel团队以C-木质素降解单体为原料，开展了(NH₄)₂Fe(SO₄)₂催化氧化儿茶酚单体制备粘康酸和粘康酸内酯的研究（图5）。在该反应体系中，儿茶酚单体M1，M2，M3可以高得率地转化为相应的粘康酸内酯。2022年，北京林业大学宋国勇教授团队报道了催化转化丙烯基儿茶酚M5制备一系列功能性分子骨架的研究，这些分子骨架通常涉及合成生物活性分子的路线。此外，作者以蓖麻种皮为原料，通过4步或5步反应，分别合成了天然产物安纽洛林和抗肿瘤药物CC-5079，其步骤效率优于已报道的合成路线。由产物结构可知，C-木质素降解单体中的大部分原子出现在最终产物中。从儿茶酚单体到下游产物的研究为C-木质素进一步高值利用提供了一条新路径。

从C-木质素到儿茶酚过程的生命周期评价

2016年，基于Anastas的实验数据，Eckelman研究了从石栗种皮制备儿茶酚单体的过程模拟和生命周期评估。与传统的化石结果相比，C-木质素转化途径在环境方面的影响总体减少，主要包括全球变暖、生态毒性效应和化石燃料消耗等。为了减轻生物质基路线的环境负担，作者建议在提取C-木质素时避免使用二氯甲烷溶剂。

C-木质素制备碳纤维

碳纤维具有体积大、性能高的特点，在航空航天、土木工程、军事、汽车运动和竞技运动等行业非常受欢迎。2016年，D’Souza教授团队以碱提取的香荚兰C-木质素为原料制备了碳纤维材料（图5）。由拉曼分析可知，C-木质素制备的碳纤维具有较高的G/D值，这与C-木质素中杂质含量少是相关的。纳米压痕结果表明，C-木质素基碳纤维的横向模量和轴向模量均优于硫酸盐木质素制备的碳纤维。由于C-木质素具有均一性、线性和低分子量等特点，它有希望成为一种新型可再生碳纤维的资源。

Figure 5. Overview of lignin valorization. (A) Depolymerization of G/S-lignin into monomers. (B) C-lignin valorization for producing catechol derivatives and fabricating carbon fibers. The mass yields of catechols based on original feedstock (mg_catechols/g_{seed coats}) were calculated according to reported data for quantitative comparisons.

自2012年C-木质素被报道以来，该研究方向逐渐成为植物代谢工程和生物质转化领域的新前沿之一。植物学家在体内、体外开展了咖啡醇单体的生物合成及其后续氧化聚合过程的研究，为通过基因工程方法将C-木质素引入到常见木质纤维素中提供了一个重要的理论基础。根据降解和非降解分析方法，目前在兰科、仙人掌科、大戟科及醉蝶花科等植物种皮中发现了C-木质素；同时实现了C-木质素的分离、纯化。与常规的G/S-木质素相比，C-木质素具有线性、均一性及耐酸性能，可用于制备单一的儿茶酚产物和高性能碳纤维。

尽管C-木质素研究取得了相当大的进展，但是该领域研究仍处于初级阶段，在C-木质素化学方面仍有许多未解决的问题和挑战（图6）。目前，为了克服C-木质素原料的局限性，开发有效的生物工程技术将C-木质素引入到常见木质纤维素中，以及寻找其他富含C-木质素的生物质是非常重要的。当前的C-木质素催化降解体系通常需要高负载量的贵金属催化剂和苛刻的反应条件，不利于工业应用。因此，设计低成本、高效的催化剂在温和的反应条件下解聚C-木质素，是C-木质素高值利用优先考虑的方向之一。同时，利用C-木质素降解的儿茶酚单体合成药物分子也是C-木质素高值化应用的一个研究方向。鉴于儿茶酚基团在贻贝衍生化学中起着核心作用，C-木质素降解的儿茶酚单体通过侧链的功能化及聚合可以制备先进的材料。此外，C-木质素的线性结构和耐酸性能也表明它可以作为一种辅助原料用于制备高性能的生物基材料。

Figure 6. A diagram of C-lignin development.